重组毕氏酵母发酵过程的结构模型

分析了毕氏酵母（Pichia pastoris)以甘油和甲醇为碳源时的代谢途径，建立了胞内物质流和能量流的平衡方程－结构模型。经过适当的降维，解得比碳源消耗速率，比氧消耗速率，比乙酰辅酶A生成速率，细胞比生长速率等关键反应速率。结合反应器模型获得操作变量与过程状态变量间的关系。用实验数据对模型进行了初步验证。结果表明，该模型能较准确地描述细胞生长和重组蛋白合成过程。     

基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白

在摇瓶条件下对基因工程菌Pichia pastoris的发酵条件进行了实验，并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在分批发酵时，接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为20左右时，细胞生长的延迟期约为2.11h，细胞生长光密度与培养时间的关系模型为：y=0.7841e^0.2319t（线性相关系数r=0.9936）；在补料发酵时细胞浓度可达115g/L-160g/L（干重），在120h重组人血清白蛋白表达量达3.6g/L。     

Kex2p在甲醇酵母中的分泌表达

通过PCR方法得到去除C端201个氨基酸残基（胞浆区，跨膜区和Ser/Thr丰富区）的Kex2p的DNA片段，并将该片段装载到质粒pPICZ-C中构建成表达质粒pPICZ-C-KEX2ΔCP。经过大肠杆菌（DH5α）的扩增，表达质粒被转入甲醇酵母（GS115）中，并得以分泌表达。发酵上清液中存在切割肽链中双碱性氨基酸C端的酶活力，SDS－PAGE电泳的结果证实了Kex2p的分泌表达，以及Kex2p在溶液中的自降解。     

巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶

对巴斯德毕赤酵母GS115菌株在工业培养基中发酵和分离条件进行了研究。结果表明：将传统工业培养基中碳源和氮源的质量浓度分别降低至35 g/L和5 g/L时,酵母生长期的细胞密度与传统培养基的相差不大,但培养时间可减少4 h,节省了生产成本;维持诱导期间的pH值为4.0对目标蛋白的表达最有利,目标蛋白的表达量占酵母分泌蛋白总量的70％,比原来增加了近30％;分离纯化过程,采用将强阳离子（SPFF）与弱阴离子（DEAE）交换层析柱偶联的分离方法,达到除杂,并浓缩目标蛋白的作用,目标蛋白产量约为50 mg/L;将目标蛋白酶切后,质量酶活性为8.56×10-3 mol/(s•g)。     

降解柴油的耐盐酵母菌的鉴定及性质研究

从胜利油田被石油污染的土壤中分离到一株能降解柴油的酵母菌YH—41。根据形态学特征、生理生化特征和分子生物学方法对其进行了鉴定。利用紫外分光光度法测定了该菌对柴油的降解率。通过单因素试验及正交试验确定了该菌对柴油的最适降解条件为pH6、温度30℃、通气量(锥形瓶容积)500 mL、接种量(OD600)3 mL。克隆了该菌的18S rDNA序列并进行测序,以18S rDNA序列同源性为基础构建了相关属种的系统发育树。结果表明YH—41与假丝酵母属(Candida)的奥默毕赤酵母(Pichia ohmen)的单倍体极接近。经优化菌体对柴油的降解率达到46.8%。经GC-MS分析可知,该菌种对柴油有很好的降解能力。     

毕赤酵母表达风味强化肽的分离与纯化

为了开发新型风味强化剂,采用硫酸铵分段盐析法、中空纤维超滤、阴离子交换树脂分离等方法,对构建的工程菌P.,postoris GS115-16B2发酵表达的16拷贝风味强化肽的分离纯化效果进行研究.实验结果表明,分离纯化最佳方法为:首先使用中空纤维进行超滤浓缩,经过两次稀释过滤浓缩后的浓缩液再采用离子交换树脂DEAE–52进一步分离纯化.经SDS-PAGE检测,纯化后16拷贝风味强化肽的平均纯度可达93.19%.     

毕赤酵母甲醇利用及甲醇蛋白发酵条件优化

利用毕赤酵母(Pichia pastoris)作为甲醇蛋白生产菌种,探究甲醇作为糖类替代碳源时毕赤酵母对甲醇的利用情况,并对甲醇蛋白发酵生产过程中的关键因素进行较为全面的考察和优化.依据试验结果,初步确定了摇瓶水平发酵各因素的最优条件为接种量9%,发酵温度采用30℃,初始p H值为5.0,装液量为40 m L/250 m L摇瓶,转速为210 r/min.在此条件下,得到的甲醇蛋白最高产量(细胞干质量)为1.63 g/L.     

阿魏酸酯酶O42807在毕赤酵母GS115中的表达

研究阿魏酸酯酶O42807基因(fae)在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达及重组阿魏酸酯酶的酶学特性.化学合成fae基因序列,构建分泌型重组质粒pPIC9K-fae,经线性化后电转化至毕赤酵母GS115,对筛选出的高活性转化子进行诱导表达.SDS-PAGE分析显示:发酵上清液为单一条带,表观相对分子质量为42 ku,酶活为78.49 nkat·mL^-1,比活力为524.38 nkat·mg^-1,最适反应温度为50 ℃,在40~45 ℃温度范围内较稳定,最适反应p     

山蛭素（haemadin）在毕赤甲醇酵母中的表达及其性质鉴定

人工合成山蛭素基因后,利用基因重组的方法将山蛭素的基因克隆到pPicZαA载体,经过线性化,电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500 μg/mL的zeocin筛选得到高拷贝插入的GS115-H菌株,经过优化摇瓶表达条件表达量达到100 mg/L。摇瓶培养物经离心取上清,分别使用3 kD和10 kD的超滤膜超滤,阳离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化步骤之后,得到纯度高于95%的目的蛋白,产出量为40 mg/L,回收率为40%。通过以chromozym TH为底物的凝血酶酰胺水解实验证实了其体外生物学活性：其抑制凝血酶常数为(2.46±0.13)×10^-13 mol/L。     

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHCMVp的研究

目的：提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法：将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS—PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果：摇瓶培养时,转化子在体积分数1％的甲醇pH6．0的条件下诱导72h,A600(菌体密度)为45．2,目的蛋白表达量达到10．2mg／L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1％甲醇诱导48h,最终A600(菌体密度)达到124,每升发酵液中含目的蛋白57．21mg。结论：通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。